Giardia duodenum organîzmek parazît e ku dibe sedema giardiasis, enfeksiyonek rûvî bi taybetî di zarokên piçûk de ku bi nîşanên klînîkî yên îshalê re hevpar e.Me berê ragihandibû ku G. duodenalis derveyî hucreyî aktîvkirina receptora oligomerîzasyona-mîna hucreyî 3 (NLRP3) ya nukleotîdên girêdide dike û bersivên înflamatuar ên mêvandar bi vezîka vezîkula derveyî hucreyî (EV) bi rê ve dibe.Lêbelê, şêwazên molekular ên rastîn ên duodenococcal EV (GEV)-girêdayî pathogen-ê ku di vê pêvajoyê de têkildar e û rola înflamazoma NLRP3 di giardiasis de dimîne ku were ronî kirin.
Plazmîdên vegotina eukaryotîkî yên rekombînant pcDNA3.1 (+)-alpha-2 û giardînên alpha-7.3 di GEV de hatin çêkirin, di makrofajên peritoneal ên seretayî yên mişkî de hatin veguheztin, û bi pîvandina molekula hedefa iltîhaba caspase-1 ve hatin tespît kirin.Asta îfadeya p20 hate pêşandan..G. duodenalis alpha-2 û alpha-7.3 giardines bi eslê xwe bi pîvandina înflamazoma NLRP3 (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 û caspase-1 p20), înflamazoma IL hatin nas kirin.Asta 1β, astên oligomerîzasyonê yên proteîna xalî ya apoptotîk (ASC), û herêmîkirina immunofluorescent ya NLRP3 û ASC.Dûv re rola înflamazoma NLRP3 di pathogenîkbûna G. duodenalis de bi karanîna mêşên ku tê de aktîvkirina NLRP3 hate asteng kirin (mişkên astengkirî yên NLRP3) hate nirxandin û guhertinên patholojîkî di giraniya laş de, barkirina parazît a duodenal, û tevna duodenal de hate şopandin.Wekî din, me lêkolîn kir ka hiardines alpha-2 û alpha-7.3 di vivo de bi navgîniya înflamazoma NLRP3 ve vekirina IL-1β çêdike û rola van molekulan di pathogenîzma G. duodenalis de di mişkan de destnîşan kir.
Alpha-2 û alpha-7.3 giardine aktîvkirina înflamazoma NLRP3 di vitro de çêdikin.Ev bû sedema aktîvkirina p20 caspase-1, zêdebûna asta îfadeya proteînên NLRP3, pro-IL-1β, û pro-caspase-1, zêdebûnek girîng di derziya IL-1β de, avakirina deqên ASA di nav xwînê de. sîtoplazma, û vegirtina oligomerîzasyona ASA.NLRP3 iltîhaba Windabûna penîsê di mişkan de patojenîtiya G. duodenalis zêde dike.Mişkên ku ji mêşên blokekirî yên NLRP3 bi kîstan hatine dermankirin, hejmareke zêde ya trofozoît û zirarek giran li vîlika duodenal nîşan dan, ku bi çîpên nekrotîk ên bi şkestin û şax ve têne diyar kirin.Ceribandinên in vivo destnîşan kirin ku giardines alpha-2 û alpha-7.3 dikarin bi riya înflamazoma NLRP3 vebûna IL-1β derxînin, û vakslêdana bi giardines alpha-2 û alpha-7.3 di mişkan de pathogenîzma G. duodenalis kêm kir.
Bi hev re, encamên vê lêkolînê destnîşan dikin ku giardia alpha-2 û alpha-7.3 dibin sedema bilindkirina iltîhaba NLRP3 ya mêvandar û enfeksiyona G. duodenalis di mişkan de kêm dike, ku ji bo pêşîgirtina giardiasis armancên sozdar in.
Giardia duodenum parazîtek protozoanek derveyî hucreyî ye ku di rûviya piçûk de dijî û salane dibe sedema 280 mîlyon bûyerên giardiasis bi îshal, nemaze di nav zarokên piçûk ên li welatên pêşkeftî de [1].Mirov bi vexwarina ava vexwarinê yan jî xwarinên ku bi kîstê M. duodenum gemarî dibin vegirtî dibin û paşê dikevin mîdeyê û di ava mîdeyê de derdikevin.Giardia duodenum trofozoites bi epîteliya duodenal ve girêdayî ye, dibe sedema gêjbûn, vereşîn, îshal, êşa zik û kêmbûna giran.Kesên ku kêmasiya immun û fibroza kîstîk heye, bi enfeksiyonê ve girêdayî ne.Infeksiyon dikare bi seksa devkî û anal jî çêbibe [2].Dermanên wekî metronidazole, tinidazole, û nitazoxanide ji bo enfeksiyonên duodenal vebijarkên dermankirinê yên bijartî ne [3].Lêbelê, van dermanên kemoterapiyê dibe sedema bandorên neyînî yên wekî nausea, karcinogenesis, û genotoxicity [4].Ji ber vê yekê, ji bo pêşîgirtina enfeksiyona G. duodenalis divê stratejiyên bi bandortir werin pêşve xistin.
Inflammasome çînek kompleksên proteîna cytosolîk in ku beşek ji bersiva xweparastinê ya xwerû ne, ji bo parastinê li hember êrişa pathogenê dibin alîkar û navbeynkariya bersivên înflamatuar dikin [5].Di nav van înflamazoman de, receptora oligomerîzasyona-girêdayî ya nukleotîdê (NOD) 3 (NLRP3) oligomerîzasyona nukleotîd-girêdayî (NLRP3) înflamazoma mîna-girêdayî ya nukleotîdê bi berfirehî hatiye lêkolîn kirin ji ber ku ew dikare ji hêla cûrbecûr pathogen / şêwazên molekularî yên bi zirarê ve were tesbît kirin. DAMP), pergala berevaniya xwerû nas dike, çalak dike.û di gelek nexweşiyên înflamatuar de homeostaza rûvî birêkûpêk dike [6,7,8].Ew ji receptorê nasîna nimûneyê (PRR) NLRP3, proteînek pêvekirî ya apoptotîk (ASC), û bandorkerek procaspase-1 an procaspase-11 pêk tê.Inflammasome NLRP3 wekî mêvandar li dijî ketina pathogen tevdigere, wekî ku di lêkolînên Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] û Leishmania de tê dîtin.[11], lê di heman demê de hate ragihandin ku aktîvkirina înflamazoma NLRP3 bersivên parastinê yên parastinê sînordar dike û pêşveçûna nexweşiyê, mînakî, di kurmî de [12].Li ser bingeha vedîtinên meyên berê, me ragihand ku G. duodenalis derveyî hucreyî aktîvkirina hundurîn a iltîhaba NLRP3 vedigire û bersivên înflamatuar ên mêvandar bi derxistina vezîkên derveyî hucreyî (EVs) modul dike [13].Lêbelê, rola înflamazoma NLRP3 di enfeksiyona G. duodenalis di vivo de dimîne ku were destnîşankirin.
Giardins bi eslê xwe wekî hêmanên avahîsaz ên cytoskeleton G. duodenalis hatine binav kirin û rolek girîng di tevgera trofozoît û girêdana hucreya epithelial de di rûviya piçûk de dileyzin.Ji bo ku çêtir xwe bi hawîrdorê re biguncînin û patojeniya xwe zêde bikin, trofozoîtên G. duodenalis avahiyek sîtoskeletal a yekta ku ji 8 flagella, 1 laşê navîn, û 1 dîska zikê pêk tê, pêşve xistin [14].Trofozoîtên Giardia duodenum sîtoskeletonê xwe bikar tînin da ku bikevin roviya piçûk a jorîn, nemaze duodenum, û bi enterocîtan ve girêbidin.Ew bi domdarî koç dikin û bi karanîna metabolîzma hucreyê ve bi şaneyên epithelial ve têne girêdan.Ji ber vê yekê, têkiliyek nêzîk di navbera cytoskeleton û ziraviya wan de heye.Giardînên taybetî yên ji bo Giardia duodenum pêkhateyên avahiya sîtoskeletonê ne [15] û li çar çînan têne dabeş kirin: α-, β-, γ-, û δ-giardine.21 endamên malbata α-giardin hene, ku hemî jî xwedan şiyana kalsiyûmê ya girêdayî fosfolîpîdan in [16].Her wiha sîtoskeleton bi parzûna xaneyê ve girê didin.Di kesên bi îshal ku ji hêla G. duodenalis ve hatî çêkirin de, α-giardîn di dema enfeksiyonê de pir zêde têne xuyang kirin û immunoreaktîf in [17].Vakslêdanên heterolog ên ku li ser bingeha Giardia alfa-1 li dijî giardiasis di mişkan de têne parastin û ji bo pêşkeftina vakslêdanê antîjenên berendamê potansiyel in [18].Alpha-8 giardin, ku di parzûna plazmayê û flagella de cih digire, lê ne di dîska zikê de ye, tevger û rêjeya mezinbûna trofozoîtan di G. duodenalis de zêde dike [19].Alpha-14 giardin bi strukturên mîkrotubulê yên li ser flagella ve tê girêdan û bandorê li zindîbûna G. duodenalis dike [20].Alpha-11 giardine di tevaya çerxa jiyanê de bi pirranî heye, û zêde îfadekirina alpha-11 giardine zirarê dide G. duodenalis bi xwe [21].Lêbelê, ne diyar e ka alpha-2 giardine û alpha-7.3 giardine li hember enfeksiyona G. duodenalis û mekanîzmayên wan ên bingehîn parastinê ne.
Di vê lêkolînê de, plasmîdên vegotina eukaryotîkî yên rekombînant pcDNA3.1 (+)-alpha-2 giardine û pcDNA3.1 (+)-alpha-7.3 giardine di makrofajên peritoneal ên seretayî yên mişkî de hatin veguheztin da ku NLRP3 mêvandar çalak bikin.Dûv re armancên înflamazomê hatin kontrol kirin.Her weha me rola înflamazoma NLRP3 di pathogenîkbûna G. duodenalis de nirxand, lêkolîn kir gelo alpha-2 û alpha-7,3 giardine çalakkirina înflamazoma NLRP3 di vivo de çêdike, û destnîşan kir ku ev her du rola giardines di pathogenicity de G. duodenalis.Armanca me ya hevpar ew bû ku em ji bo pêşîlêgirtina enfeksiyona G. duodenalis armancên hêvîdar pêş bixin.
Cureya çolê (WT) C57BL/6 mişkên mê yên 5-8 hefteyî ji Navenda Heywanên Ezmûnî ya Liaoning Changsheng (Liaoning, Çîn) hatin kirîn.Mişk belaş gihîştina avê, xwarina sterilkirî distînin û di çerxa ronî/tarî ya 12/12 saetan de hatine ragirtin.Berî enfeksiyonê, mêşan antîbiyotîkên adil di ava vexwarinê de bi ampicillin (1 mg/ml), vancomycin (1 mg/mL), û neomycin (1,4 mg/mL) (hemû ji Shanghai, Chinaîn, organîzmayên çêkirî hatine kirîn) distînin [22 ].].Mişkên ku ji bo > 24 saetan şiyana xwarin û vexwarinê winda kirin û ≥% 20 giraniya laşê wan winda kirin, bi jihevketina malzaroka malzarokê bi awayekî însanî hatin eutanîzekirin.
WB G. duodenalis trophozoites (Kolêksiyona Çandî ya Tîpa Amerîkî, Manassas, USA) bi %12,5 seruma bezê fetal (FBS; Every Green, Zhejiang, Chinaîn) û 0,1% zerika gayan (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) hatin zêdekirin. ).USA) di bin şert û mercên mîkroaerobî de.Trofozoîtên hevgirtî li ser qeşayê hatin berhev kirin û ji bo nûveberdana bêtir bi rêjeyek 1:4 derbas bûn.
Kîstên Giardia duodenum wekî ku berê hate destnîşan kirin [23] hatin çêkirin, trofozoît di qonaxa logarîtmîkî de hatin berhev kirin û dûv re bi navgîniya îndukasyona encapsulasyonê, pH 7.1 (guhartin TYI-S-33) bi giraniya paşîn a 1 × 106 trofozoît / mL hatin rijandin.giraniya bile 0,05% navîn).Trofozoît di bin şert û mercên anaerobîk de li 37°C heta qonaxa mezinbûna logarîtmîkî hatin çandin.Navgînê biguhezînin navgîna ku kîstê çêdike (pH 7,8; ​​navgîna TYI-S-33 ya guhertî bi %1 giraniya bîle) û çandiniya G. duodenalis li 37°C ji bo 48-96 saetan, di dema ku kîstên çêbûnê de di bin mîkroskopê de hatin dîtin.Piştî ku piraniya trofozoîtan ji bo çêkirina kîstan hatin derxistin, tevliheviya çandê hate berhev kirin û ji nû ve di ava deionized sterîl de hate sekinandin da ku trofozoîtên mayî lîz bike.Kîst hatin jimartin û di 4°C de hatin hilanîn ji bo analîzên paşerojê bi lûleya mîdeyê li mişkan.
Vezîkeyên derveyî hucreyî yên Giardia (GEVs) wekî ku berê hatî destnîşan kirin dewlemend kirin [13].Trofozoîtên di qonaxa mezinbûna logarîtmîkî de di navgîniya TYI-S-33 a guhezbar de ku bi FBS-a exozomê-teqirkirî (Pîşesaziyên Biyolojîkî, Beit-Haemek, Israel) hatî amadekirin ji nû ve hatin sekinandin û heya 12 demjimêran 106 parazît / mL hate înkubakirin.bi santrîfujasyonê li 2000 g ji bo 10 hûrdem, 10,000 g ji bo 45 min, û 100,000 g ji bo 60 hûrdem, ji supernatantê çandê hatin veqetandin.Barîn di salona tampon a fosfatê (PBS) de hatin hilweşandin, bi karanîna kîteyek testa proteîna BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) hatin jimartin û li -80 ° C. hatin hilanîn an rasterast ji bo analîzên din têne bikar anîn.
Makrofajên peritoneal ên seretayî yên mişkî wekî ku berê hate diyarkirin [24] hatin amadekirin.Bi kurtasî, mişkên (temenê 6-8 hefteyî) bi 2,5 ml 2,98% 2,98% Difco navgîna thioglycol a şil (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) hatin derzîkirin (intraperitoneally [ip]) û 3-4 paldan xwarin.Piştî eutanaziyayê suspensionek makrofaj ji valahiya zikê mişkan hat komkirin û 3 caran di 1000 g ji bo 10 deqeyan santrîfuj kirin.Hucreyên berhevkirî ji hêla sîtometrîya herikînê ve bi karanîna nîşankera CD11b hatin tesbît kirin heya ku paqijiya şaneyê bû> 98%, dûv re li lewheyên çanda şaneyên 6-kalî (4,5 x 106 şanî / kanî) hatin zêdekirin û bi 10% FBS (Bioindustriya) li 37°C ve hatin inkubasyon.û 5% CO2.
RNA ji 1 × 107 trofozoît di 1 ml reagenta TRIzol (Vazyme, Nanjing, Çîn) de hate derxistin, ADNya genomîk ji RNA ya G. duodenalis bi karanîna MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Chinaîn) hate derxistin û DNA ya temamker (cDNA) hate sentez kirin. bi karanîna MonScript RTIIII Super Mix (Monad) li gorî rêwerzên çêker.
Agahdariya rêza CDS ya ji bo gena hedefa G. duodenalis ji GenBank NCBI hate wergirtin.Primer 5.0 bikar bînin da ku ji bo her genê armancê primerên klonkirinê yên bêkêmasî dîzayn bikin.Destpêka pêşîn (5'-3') ji sê beşan pêk tê: rêzek hevgirtî bi vektorek xêzkirî pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) û kodonên ATG û GNN dest pê dike (heke bingeha yekem ne G be).Ev ji bo baştirkirina karîgeriya îfadeyê tê kirin.Bi ser de jî, bi kêmanî 16 bp bingehên hevgirtî (naveroka GC 40–60%/Tm nêzî 55 °C).Destpêka berevajî (5'-3') ji du beşan pêk tê, rêzek hevgirtî bi vektorek pcDNA3.1(+)-xêzkirî ya EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) û bingehek hevgirtî ya herî kêm 16 bp.(ji bilî du rawestgehên dawîn).baz) kodonek wek AA an GA ku destûrê dide plasmîdên rekombînant ku proteînên xwe yên nîşankirî diyar bikin).Rêzên pêşîn di Tabloya 1-ê de têne navnîş kirin û ji hêla Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Chinaîn) ve hatine sentez kirin.
Armanc bi karanîna Pfu DNA polymerase (Tiangen, Pekîn, Chinaîn) an Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Peking] Co., Ltd., Pekin, Chinaîn) bi karanîna cDNA ya amadekirî ya G. duodenalis wekî şablon hatin zêdekirin.Plazmîda vektora îfadeya eukaryotî pcDNA3.1 (+) bi enzîma sînordar EcoRV re hate rêzkirin û bi karanîna Fast AP (Thermo Fisher Scientific) hate defosforîl kirin.Parçeyên pcDNA3.1 (+) yên xêzkirî û perçeyên genê yên armanckirî yên zêdekirî bi karanîna kîteyek paqijkirina gel a DNA (Tiangen) hatin paqij kirin û bi karanîna Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) hate pîvandin.Parçeya pcDNA3.1 (+) û her perçeyek genê ya armancê bi karanîna tevliheviya klonkirinê ya yekane ya MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Chinaîn) ji nû ve hatin berhev kirin û bi rêzgirtina DNA bi karanîna Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Chinaîn) ve hate pejirandin..
Plazmîdên bê endotoxin pcDNA3.1 (+)-alpha-2 û pcDNA3.1 (+)-alpha-7.3 bi karanîna SanPrep-Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) hatin çêkirin.Kêmbûn li jor 500 ng/µl hate domandin da ku pê ewle bibe ku EDTA di tamponê elusyonê de mudaxeleyî ceribandina veguheztinê neke.Makrofajên peritoneal ên mişkî yên seretayî di nav lewheyên 6-kaniyê de bi navgîniya RPMI 1640 ya bêkêmasî (Pîşesaziya Biyolojîk) 12 demjimêran hatin çandin, dûv re hucre 3 caran di PBS-a germ de hatin şûştin da ku penîsîlîn û streptomycin werin rakirin, û dûv re jî di navgînê de bi navgînek bêkêmasî hate zêdekirin.Plazmîdên bê endotoksîn pcDNA3.1 (+)-alpha-2 û pcDNA3.1 (+)-alpha-7.3 (2.5 μg) di 125 μl Opti-MEM navgîna serumê ya kêmkirî (Gibco, Thermo Fisher Scientific) de hatin rijandin..Dûv re 5 μl reagenta veguheztinê ya Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) di 125 μl navgîna seruma kêm Opti-MEM de hate rijandin.Kompleksên liposom-DNA-yê amade bikin bi tevlihevkirina plasmîdê bê endotoksîn û bi Lipofectamine 2000 re û bihêlin ku tevlihev 5 hûrdeman li germahiya odeyê bimîne.Kompleksan ji hev cuda veguhezînin hucreyên di her bîrê de û hêdî hêdî tevlihev bikin.Piştî 4 saetan, navgîna çanda şaneyê bi 2 ml navgînek tam RPMI 1640 hate guheztin û çand 24 demjimêran berdewam kir.Navgîna çanda hucreya nû li hucreyan hate zêdekirin û li gorî sêwirana ceribandinê ji bo demên cihêreng hate inkubasyon.
Nimûneyên proteînê yên ji supernatant û lîzên hucreyê wekî ku berê hatî destnîşan kirin hatin amadekirin [25].Parametreyên veguheztina membranê ji bo pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, û His-tag 200 mA / 90 min bûn.Ji bo interleukin 1β (IL-1β; Pergalên R&D, Minneapolis, Minnesota, USA), kaspase-1 (p20) (Adipogen, Swîsre) û NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Swîsre) û 1:5000 etîketa Wî armanc dike ( Amylet Scientific, Wuhan, Çîn) û β-actin (Proteintech, Wuhan, Çîn).
Xaç-girêdana bi disuccinimide suberate (DSS) wekî ku berê hatî destnîşan kirin hate kirin [26].Hucre 3 caran bi PBS sar hatin şûştin û bi derziyek 27 gauge bi tevahî di 50 µl tampon reaksiyonê ya ASC (pH 8.0) ku tê de 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES û 125 mM NaHCO3 tê de, hatin lîzkirin.Tevlîhev 3 hûrdem li 5000 g hate santrîfuj kirin û pellet bi 10 μl DSS (25 mM li DMSO) û 40 μl tampon reaksiyonê ya ASC ji bo 30 hûrdeman li 37 °C hate kişandin.Piştî santrîfujasyonê li 5000 g ji bo 10 hûrdeman, pellet di nav çareyek ji 40 μl tampon reaksiyona ASC û 10 μl tampon barkirina proteînê 6x (TransGen, Pekîn, Chinaîn) de hate hilweşandin, û dûv re çareserî ji bo 15 demjimêran li germahiya odeyê hate qut kirin. min., Paşê 10 deqîqeyan bikelînin.Dûv re nimûneyên proteînê bi karanîna antîbozên antî-ASC yên seretayî (Wanleibio, Shenyang, Chinaîn) bi rêjeyek helandinê ya 1:500 ve bi blota rojavayî ve hatin kirin.
Li dû pêvajoyek ku berê hatî destnîşan kirin [13], supernatantên çanda hucreyê hatin berhev kirin û bi karanîna kîtê IL-1 Beta ELISA (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) cytokina pro-înflamatuar IL-1β hate destnîşankirin.Nirxên OD450nm bi karûbarê standarda IL-1β veguhezînin hûrgelên proteînê.
Hucreyên ku li ser çîpên pêçandî bi nermî 3 caran di PBS-a germ de hatin şûştin, di fiksatorê hucreya tevnê (Biosharp, Beijing, Chinaîn) de 10 hûrdem li germahiya odeyê (RT), li 0.1% Triton X-Permeabilize li 100 (di PBS de hatî rijandin; Biosharp) hatin şûştin. ) 20 hûrdeman li germahiya odeyê û 2 demjimêran li germahiya odeyê 5% albûmîna seruma bovine (di PBS) de asteng bikin.Dûv re şan bi şevekê li 4°C bi antîbodên seretayî yên li dijî ASC (1:100 rijandin) an jî NLRP3 (1:100 rijandin), bi rêzê ve hatin înkubakirin, û bizina bizinê bi Cy3 nîşankirî IgG(H+L) (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, USA) an bizina bizinê ya dijî-mişk IgG (1:400; Earthox) bi şevekê li 37°C di tariyê de ji bo 1 saetê.Navok 5 hûrdem bi Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Çîn) hatin boyaxkirin û di bin mîkroskopa floransê de (Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) hatin dîtin.
Mişk li çar koman hatin dabeş kirin (di her komê de n = 7): (i) Koma kontrolê ya neyînî ya ku bi PBS hatî derman kirin (tenê PBS; 100 μl/mişk PBS veqetandin û dûv re derziya rojane ya hundurîn 100 μl/mişk PBS 3 demjimêran şûnda) ., berdewam ji bo 7 rojan);(ii) koma kontrolê ya neyînî ya ku bi înhîbîtorê MCC950 [27] hat dermankirin (100 μl/mişk bi rêya PBS gavajê, 3 saet şûnda, 10 mg/kg giraniya laş [BW] MCC950 [di PBS] de rojane di hundurê perîtoneyê de, dirêjahiya 7 rojan) hate rêvebirin);(iii) Koma enfeksiyona kîstê ya G. duodenalis (1,5 x 106 kîst/mişk bi rêya gavajê, 3 saet şûnda, 100 μl/mişk PBS 7 rojan rojane di hundurê perîtoneyê de tê dayîn);(iv) Koma enfeksiyonê ya G. duodenalis grûba enfeksiyonê ya hevgirtî Koma MCC950 ya dermankirinê (1,5×106 kîst/mişk bi rêya gavajê, 10 mg/kg giraniya laş MCC950 rojane 7 rojan di 3h de) rojane intraperitonely).Her roj giraniya laşê her mişkekê hate şopandin û di roja 7’an de hemû mişk hatin otozankirin.Di 1 ml PBS de duodenuma (dirêj 3 cm) hatî berhevkirin, di 1 ml PBS de perçeyên piçûk hate birîn, kîst di şevekê de li PBS di 4 °C de, û trofozoîtên G. duodenalis hatin hilweşandin.Duodenuma nû (1 cm dirêj) ji bo rengkirina hematoxylin û eosin (H&E) hate veqetandin.
Mişk li du koman hatin dabeş kirin: (i) koma kontrolê ya MOCK û (ii) koma mêtinger a MCC950.Di her komê de pênc dermankirin (n = 7/koma dermankirinê) hebûn: (i) Koma kontrolê ya neyînî ya dermankirina PBS (tenê PBS; 100 μl/mişk PBS, derziya intramuskuler (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) koma kontrolê ya neyînî ya plasmidê (100 μg/DNA mişk, bi derzîlêdana hundirê masûlkeyê) (iii) Koma kontrolê ya erênî ya enfeksiyona kîsta G. duodenalis (1,5 x 106 kîst/mişk, bi rêya gavajê) (iv) a); koma ku bi plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/DNA mişk, bi derzîlêdana hundirê masûlkeyê), û (v) komek ku bi plasmîd pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/mişk) hatî derman kirin DNA, piştî derbasbûna 12 saetan, mişkên di koma mêtinger a MCC950 de 7 rojan derziyek hundurîn a MCC950 (10 mg/kg giraniya laş) werdigirin, di heman demê de mişkên di koma MOCK de hêjmarek wekhev a dermankirina PBS wergirtin. Nimûneyên xwînê hatin Ji mişkên çavan hatin komkirin û di şevekê de li 4 °C hatin hiştin Nimûneyên serumê bi karanîna testa immunosorbent-girêdayî (ELISA) û pîvandina asta IL-1β hatin veqetandin.
Sî û pênc mişk li pênc koman hatin dabeşkirin (n=7/kom).Koma 1 komeke kontrolê ya neyînî bû ku bi PBS dihat derman kirin: mişkan 100 μl PBS bi navgîniya masûlkeyê û 3 roj şûnda bi rêya gavajê wergirtin.Koma 2 komeke kontrolê ya pozîtîf e ku bi kîstên G. duodenalis vegirtî ye: 100 μl PBS li mişkan hatin derzkirin, û 3 roj şûnda 1,5 x 106 kîst/mişk bi rêya intragastriyê hatin derzîkirin.Koma sêyem - imunîzasyona plasmîdê ya bi pcDNA3.1(+) re digel komeke kontrolê ji bo enfeksiyona kîsta duodenal: mişkan 100 μg DNA-ya plasmîd pcDNA3.1(+)(im) bi devkî, 1.5×106 kîst/mişk 3 ji bo çend kesan. rojan.Komên 4 û 5 pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid an jî pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 plasmid giardine rekombinant bi enfeksiyona kîsta G. duodenalis re bûn.Koma ceribandinê: mişkan 100 μg pcDNA3 wergirtin.1(+)-giardine plasmid DNA (im), paşê 3 roj şûnda, 1,5 × 106 kîst/mişk bi rêya gavagê hatin derzî kirin.Giraniya laşê her mişkek piştî danasîna kîsta G. duodenalis bi lûlê ve hate şopandin.Duodenuma nû ji bo pîvandina barkirina parazît û analîza rengkirina HE hate berhev kirin.
Guhertinên histopatholojîk li gorî pêvajoyek berê hatî weşandin [30] hate analîz kirin.Duodenuma nû bi fîksatîfê şaneya tevnvîsê hate sabît kirin, di parafîn de hate bicîkirin, li beşên 4 μm hate birîn, bi H&E hate reng kirin û di bin mîkroskopa ronahiyê de hate analîz kirin.Guhertinên patolojîk ên nûner di heft beşên tevnvîsê de ji heft mişkên serbixwe ji hêla pathologistek ku haya wan ji dermankirinê tune hate nirxandin û bi mezinbûna 200x hatin girtin.Dirêjiya bilbilan û kûrahiya krîptan li gorî rêbazên ku berê hatine destnîşan kirin hatine pîvandin.
Encamên in vitro û in vivo sê caran hatin bidestxistin.Graf bi karanîna GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) hatin çêkirin.Cûdahiyên di navbera her du koman de bi t-testê ve hatin analîz kirin, di heman demê de cûdahiyên di navbera komên ≥3 de bi karanîna nermalava SPSS (guhertoya 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) bi analîza veguheztinê ya yekalî (ANOVA) ve hate analîz kirin.Daneyên ji bo homojeniya variansê bi karanîna testa Levene û dûv re testa post-hoc ya Bonferroni (B) hate analîz kirin.Girîng wekî P<0.05, P<0.01, û P<0.001 (ne girîng [ns]) (P>0.05) tê îfade kirin.
Analîza meya berê ya proteomîkên GEV-ê di Ansîklopediya Gen û Genomên Kyotoyê (KEGG) de destnîşan kir ku dibe ku gelek armanc di aktîvkirina rêyên nîşana înflamatuar de beşdar bibin [13].Me du armancên sozdar hilbijart, alpha-2 û alpha-7.3 giardîn, van molekulan zêde dike û wan bikar tîne da ku vektora îfadeya eukaryotî ya pcDNA3.1 (+) ava bike.Piştî rêzgirtinê, plasmîdên derbirînê yên pcDNA3.1(+)-alpha-2 û alpha-7.3 giardine rekombînant di nav makrofajên peritoneal ên seretayî yên mişkî de hatin veguheztin, û proteîna nîşana caspase-1 p20 ya iltîhabayê (parçeyek ji caspase-1-ê aktîfkirî) hate nas kirin. wekî molekulên sereke ronî dikin ku dikarin iltîhaba çêkin.Encaman destnîşan kir ku alpha-2 û alpha-7.3 giardines dikarin îfadeya p20 caspase-1 mîna GEV-ê derxînin.Tu bandorek li ser aktîvkirina kaspase-1 di kontrola neyînî ya nehatî dermankirin (tenê PBS) û pcDNA3.1 (+) plasmid kontrolê de nehat dîtin (Wêne 1).
Pîvana aktîvkirina p20 caspase-1 ji hêla pcDNA3.1 (+) -alpha-2 û alpha-7.3 giardins.Plazmîdên îfadeya eukaryotî yên rekombînant pcDNA3.1(+)-alpha-2 û alpha-7.3 giardînên (li jor her hêlekê) di makrofajên peritoneal ên seretayî yên mişkî de hatin veguheztin û 24 demjimêran şûnda supernatantên çandê hatin berhev kirin.Western blotting ji bo pîvandina asta îfadeya proteîna înflamasome ya caspase-1 p20 hate bikar anîn.Koma tedawiya PBS-tenê (lane C) û koma pcDNA3.1 (+) monoterapî (pcDNA3.1 lane) wekî kontrolek neyînî, û koma dermankirina GEV wekî kontrolek erênî hate bikar anîn.Vebijandina proteîna rekombînant bi vedîtina tagek histidine di her proteînekê de hate pejirandin, û bendên proteîn ên çaverê alpha-2 giardine (38.2 kDa) û alpha-7.3 giardine (37.2 kDa) bûn.GEV, vektorên derveyî hucreyî yên Giardia duodenum, pcDNA3.1 (+), vektora xêzkirî ya EcoRV, SUP, supernatant
Ji bo destnîşankirina ka alpha-2 giardine û alpha-7.3 giardine îfadeya p20 caspase-1 çêdikin û di aktîvkirina bersiva înflamatuar a host NLRP3 de, pcDNA3.1 (+)-alpha-2 giardine û pcDNA3.1 (+)-alpha de rolek dileyzin. -7.3 giardin di makrofajên peritoneal ên seretayî yên mişkî de bi DNA-ya plasmîdê ya rekombînant ve hate veguheztin, û astên vegotinê, herêmîbûn, û oligomerîzasyona proteînên sereke yên înflamatuar NLRP3 hatin destnîşankirin.Di vê ceribandinê de, GEV wekî koma kontrolê ya erênî hate bikar anîn, û koma bê dermankirinê (tenê PBS) an koma dermankirina veguheztina pcDNA3.1 (+) koma neyînî bû.Encaman destnîşan kir ku, wekî di koma GEV de, DNA-ya plasmidê ya rekombînant a giardin pcDNA3.1 (+)-alpha-2 û giardin pcDNA3.1 (+)-alpha-7.3, bû sedema bilindkirina NLRP3, pro-IL-1β û aktîvkirina procaspase-1 û caspase-1 (Hêjîrê. 2a).Digel vê yekê, her du giardine veşartina girîng a IL-1β derxistin (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Wêne 2b).Piraniya proteînên ASC-ê di koma bê-dermankirinê de an di koma dermankirinê de ku bi pcDNA3.1 (+) plasmid ve hatî veguheztin monomer bûn, berevajî pcDNA3.1 (+)-alpha-2 an pcDNA3.1 (+)-alpha-. 7.3 giardine.Olîgomerîzasyona ASC di DNA-ya plasmîdê ya rekombînant a grûp an komê ya kontrolê ya erênî ya GEV de çêbû, ku formek oligomerîk nîşan dide (Wêne 2c).Van daneyên pêşîn destnîşan dikin ku alpha-2 giardine û alpha-7,3 giardine dikarin çalakkirina iltîhaba NLRP3 bikin.Lêkolînên paşîn ên immunofluorescent ên herêmîkirina ASC û NLRP3 destnîşan kirin ku di koma kontrolê ya neyînî de, proteîna ASC li seranserê sîtoplazmayê belav bû û li ser stimulasyona pcDNA3.1 (+)-alpha-2 bi giardine an pcDNA3 re wekî nîşanek xalî xuya bû.1 (+) -alpha-7,3 koma giardine an GEV koma kontrolê ya erênî (Wêne 2d).Di komên pcDNA 3.1 ên kontrolê yên neyînî û bi plasmîd-dermankirî de, îşaretek proteîna NLRP3 nehat tespît kirin, dema ku xalek nîşanek fluorescent di bersiva pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine an pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 de. hat tesbîtkirin..giardine di sîtoplazmayê de an li ser teşwîqkirina HEV tê dîtin (Wêne. 2e).Van daneyan bêtir destnîşan dikin ku G. duodenalis giardin alpha-2 û giardin alpha-7.3 înflamazoma NLRP3 di makrofajên peritoneal ên seretayî yên mişkî de çalak dikin.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin û pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin înflamazoma NLRP3 di makrofajên peritoneal a mişkî de çalak dikin.Plazmîdên vegotinê yên eukaryotî yên rekombînant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin û pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin veguhezînin makrofaj û şaneyên peritoneal ên seretayî, an jî di nav 24 saetan de supernatant berhev bikin ji bo analîza derbirînê, oligomerîzasyon. , veşartî.û herêmîkirina proteînên înflamatuar ên sereke.Koma PBS-tenê (C) û koma dermankirinê ya pcDNA3.1 (+) wekî kontrola neyînî, û koma dermankirina GEV wekî koma erênî hate bikar anîn.Proteînên sereke yên înflamatuar NLRP3, di nav de NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, û p20 caspase-1, ji hêla Western blotting ve hatin tespît kirin.b Asta derziya IL-1β ya di nav supernatantan de bi karanîna testa immunosorbent-girêdayî enzîmê (ELISA) hate destnîşankirin.Cûdahiyên di navbera komên kontrolê û ceribandinê de bi analîzkirina veguheztinê ya yek-alî (ANOVA) bi karanîna nermalava SPSS guhertoya 22.0 ve hatin analîz kirin.Stêrk cudahiyên girîng di navbera koman de nîşan didin **P<0.01 û ***P<0.001.c Asta oligomerîzasyona ASC di pelletan de ji hêla analîza girêdana xaçerê ya DSS ve hate destnîşankirin, dema ku asta ASC di lîzên hucreyê de wekî kontrolek barkirinê hate bikar anîn.d Dîtina herêmîkirina ISC bi karanîna immunofluorescence.e Immunofluorescence hate bikar anîn da ku cîhgirtina NLRP3 nîşan bide.ASC, proteîna speck-apoptotîk;IL, interleukin;NLRP3, receptorê mîna oligomerîzasyona 3-ya ku bi nukleotîd ve girêdayî ye;ns, ne girîng (P > 0.05)
Hem G. duodenalis û hem jî GEV-yên ku ew derdixe înflamazoma NLRP3 çalak dikin û bersivên înflamatuar ên mêvandar di vitro de sererast dikin.Ji ber vê yekê, rola înflamazoma NLRP3 di pathogenîkbûna G. duodenalis de ne diyar dimîne.Ji bo vekolîna vê pirsgirêkê, me ceribandinek di navbera mêşên ku bi kîsta G. duodenalis vegirtî û mêşên ku bi kîsta G. duodenalis + dermankirina înhîbîtorê MCC950 vegirtî vegirtinek çêkir û dema ku bi kîsta G. duodenalis vegirtin de, îfadeya înflamazoma NLRP3 dan ber hev.Di jimareya 3a de nexşeyek hûrgulî ya ceribandinê tê xuyang kirin.Guhertinên giraniya laşê mişkan ên di komên dermankirinê yên cihêreng de 7 rojan piştî enfeksiyona bi kîstan hatin şopandin, û encam di jimar 3b de têne xuyang kirin.Li gorî koma ku bi PBS-a paqij hatî derman kirin, encaman nîşan da ku (i) giraniya laşê mêşên ku bi kîsta G. duodenalis vegirtî ji roja 3 heya roja 7-an piştî enfeksiyonê kêm bû;(ii) dermankirina bi astengkerê MCC950 bandorek girîng li ser giraniya laşê mişkan nebû..Li gorî koma enfeksiyonê ya yekane, BW ya koma enfeksiyona duodenal a ku bi MCC950 re hatî derman kirin bi dereceyên cihêreng kêm bû (Roja 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Roja 2: ANOVA, F(3, 24 ) = 0,4602, P<0,0001: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052 F (3, 24)=0.6497, P=0.0645 Roja 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202.Van daneyan destnîşan dikin ku înflamazoma NLRP3 di qonaxên destpêkê (2-4 roj) enfeksiyona duodenal de mêşan ji kêmbûna giraniya girîng diparêze.Dûv re me armanc kir ku trofozoîtên G. duodenalis di şilava lavajê ya duodenal de tespît bikin û encam di jimar 3c de têne xuyang kirin.Li gorî koma enfeksiyona kîsta G. duodenalis, piştî astengkirina înflamazoma NLRP3 (t(12) = 2.902, P = 0.0133, hejmara trofozoîtên di duodenumê de bi girîngî zêde bû.Tiştên duodenal ên ku bi HE re hatine xêzkirin, li gorî kontrola neyînî ya ku bi PBS û MCC950 tenê hatî derman kirin, destnîşan kir: (i) Enfeksiyona kîsta G. duodenalis bû sedema zirarê li viliya duodenal (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0488 ) û atrofiya krîptoyê (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum ji mêşên ku bi kîstên G. duodenalis vegirtî û bi înhîbîtorên MCC950 têne derman kirin.viyên duodenal zerar û mirin (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) bi atrofî û şaxkirina krîptoyê (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Hêjî. 3d- f) .Van encaman destnîşan dikin ku înflamazoma NLRP3 di kêmkirina pathogenîkiya G. duodenalis de rolek dilîze.
Rola înflamazoma NLRP3 di enfeksiyona Giardia duodenum de.Mişk (iv) bi kîstên duodenococcal hatin vegirtin û dûv re bi an bê MCC950 (ip) hatin derman kirin.Komên dermankirinê yên yekane bi PBS an MCC950 wekî kontrol têne bikar anîn.Koma ezmûnî û rejima dermankirinê.b Giraniya laşê mişkan di her yek ji komên dermankirinê yên cihêreng de 7 rojan hate şopandin.Cûdahiya di navbera koma enfeksiyonê ya G. duodenalis û koma dermankirina enfeksiyonê ya G. duodenalis + MCC950 de ji hêla t-testê ve bi karanîna nermalava SPSS versiyona 22.0 hate analîz kirin.Stêrk cudahiyên girîng li *P<0.05, **P<0.01, an ***P<0.001 nîşan didin.c Barkirina parazît bi jimartina hejmara trofozoîtên di şilava lavajê ya duodenal de hate destnîşankirin.Cûdahiya di navbera koma enfeksiyonê ya G. duodenalis û koma dermankirina enfeksiyonê ya G. duodenalis + MCC950 de ji hêla t-testê ve bi karanîna nermalava SPSS versiyona 22.0 hate analîz kirin.Stêrk cudahiyên girîng li *P <0.05 nîşan didin.d Encamên rengkirina Hematoxylin û eosin (H&E) yên histopatolojiya duodenal.Tîrên sor zerara villiyan, tîrên kesk jî zirara diranan nîşan dide.Bara pîvanê: 100 μm.e, f Analîza îstatîstîkî ya bilindahiya vîlûsê duodenal û bilindahiya şîfreya mişkê.Stêrk cudahiyên girîng li *P<0.05 û **P<0.01 nîşan didin.Encam ji 7 ceribandinên biyolojîk ên serbixwe têne girtin.BW, giraniya laş;ig, riya radestkirina intragastric;ip, riya radestkirina intraperitoneal;ns, ne girîng e (P > 0.05);PBS, saline tampon fosfat;WT, cureyê çolê
Derxistina IL-1β nîşanek çalakkirina iltîhaba ye.Ji bo destnîşankirina ka G. duodenalis alpha-2 giardine û alpha-7.3 giardine înflamazoma mêvandarê NLRP3 di vivo de çalak dikin, me mişkên WT yên nehatî dermankirin (koma şam) û mêşên înflamazoma-blokekirî yên NLRP3 (koma dermankirinê ya astengkirî MCC950) bikar anîn.Plana hûrgulî ya ceribandinê di jimar 4a de tê nîşandan.Komên ceribandinê ji mişkên ku bi PBS, tedawiya kîsta G. duodenalis bi rêya gavajê, derzîlêdana navmuskuler a pcDNA3.1, û derziya intramuskuler a pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine an jî pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine pêk dihatin.Di roja 7emîn de piştî rêveberiya intramuskuler a plasmîdê rekombînant, serum hate berhev kirin û asta IL-1β di her komê de hate destnîşankirin.Wekî ku di Figure 4b de tê xuyang kirin, di koma MOCK de: (i) li gorî koma PBS, dermankirina pcDNA3.1 bandorek girîng li ser derziya IL-1β nebû (ANOVA, F(4.29) = 4.062, P = 0.9998), lêbelê, Veşartina IL-β di koma kîsta G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine û pcDNA3 de bi girîngî bilind bû.1- Derzîlêdana alfa-7.3 giardine ya hundirê masûlkeyê asta IL-1β ya serumê bi girîngî zêde kir (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine astên bilind ên derziya IL-1β di koma pcDNA3.1-alpha-2 giardine derzîlêdanê de (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Li gorî her komê di koma dermankirinê ya MCC950 û koma MOCK de: (i) Asta veşartina IL-1β di koma kontrolê ya PBS û koma kontrolê ya pcDNA3.1 de piştî astengkirina mêtîngerê MCC950 heya radeyekê kêm bû, lê cûdahî nebû. girîng (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) piştî astengkirina MCC950., derziya IL-1β di koma G. duodenalis bi kîstê vegirtî, koma pcDNA3.1-alpha-2 giardine, û koma pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3 giardine: ANOVA, F(; ) = 3,540, P = 0,0164).Van encaman destnîşan dikin ku alpha-2 giardine û alpha-7.3 giardine navbeynkariya çalakkirina înflamazoma NLRP3 di vivo de dikin.
pcDNA3.1 (+) -giardine înflamazoma mêvandarê NLRP3 di vivo de çalak dike.Mişk bi pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine an jî pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine vakslêdan (IM) hatin parastin (IM) û paşê bi MCC950 (ip; koma MCC950) an na (koma dummy) hatin derman kirin. ).Koma tedawiya plasmîdê ya PBS an jî pcDNA3.1 (+) wekî kontrolek neyînî, koma dermankirina kîsta G. duodenalis wekî kontrolek erênî hate bikar anîn.Koma ezmûnî û rejima dermankirinê.b Asta serumê ya IL-1β di mişkan de di roja 7 de bi ceribandina ELISA hate pîvandin.Cûdahiyên di navbera komên di koma MOCK de bi karanîna ANOVA-ya yek-alî ve hatî analîz kirin, û cûdahiyên di navbera koma MOCK û koma MCC950 de bi karanîna t-testa nermalava SPSS guhertoya 22.0 hate analîz kirin.Asterisks cudahiyên girîng di navbera komên dermankirinê de di koma MOCK de destnîşan dikin, *P<0.05 û ***P<0.001;Nîşaneyên dolaran ($) di navbera her komê de di koma MOCK û koma MCC950 de di P<0.05 de cûdahiyên girîng destnîşan dikin.Encamên heft ceribandinên biyolojîkî yên serbixwe.i, derzîlêdana intramuskuler, ns, ne girîng (P > 0.05)
Ji bo vekolîna bandora alpha-2 û alpha-7.3 giardine-mediated activation of NLRP3 hosting inflammasome li ser enfeksiyona G. duodenalis, me mêşên WT C57BL/6 bikar anîn û alpha-2 giardine û alpha-7.3 giardine derzî kirin.plazmîd bi derzîlêdana hundirê masûlkeyê, piştî 3 rojan di lûleya mîde ya kîsta G. duodenalis de hate derzîkirin, piştî wê 7 rojan mişk hatin şopandin.Di jimareya 5a de nexşeyek berfireh a ceribandinê tê nîşandan.Giraniya laşê her mişkê her roj dihat pîvandin, nimûneyên tevna duodenalê ya nû di roja 7emîn de bi riya lûleya mîdeyê ve hatin berhev kirin, hejmara trofozoîtan hate pîvandin û guhertinên hîstopatolojîkî hatin dîtin.Wekî ku di jimar 5b de tê xuyang kirin, bi zêdebûna dema xwarinê re, BW ya mişkan di her komê de hêdî hêdî zêde bû.MT ya mişkan di roja 3yemîn de piştî rêveberiya intragastrik a kîstên G. duodenalis dest bi kêmbûnê kir, û dûv re hêdî hêdî zêde bû.Aktîvkirina înflamazoma NLRP3 ya ku ji hêla derzîlêdana hundurîn a alpha-2 giardine û alpha7.3 giardine ve hatî çêkirin kêmbûna giraniya di mişkan de bi girîngî kêm kir (Roja 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Roja 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Roja 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 Roja 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 : pcDNA3.1-alpha-2, ANOVA; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Roja 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 Roja 4: pcDNA3.1-ANOVA; , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Roja 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Roja 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Roja 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Roja 6: pcDNA3. alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Roja 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Roja 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Roja 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).Barkirina parazît di duodenumê de hate nirxandin (Wêne. 5c).Li gorî kontrola erênî ya nehatî dermankirin û koma ku bi vektora pcDNA3.1 vala hatî derzî kirin, di komên ku bi α-2 giardine û α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha) hatine derzîkirin, hejmara trofozoîtên G. duodenalis bi girîngî kêm bû. -2 giardîn: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardîn: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Wekî din, giardine alfa-7.3 di mişkan de ji giardine alfa-2 bêtir parastin bû (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Encamên lêdana HE di jimarê de têne xuyang kirin.5d–f.Mişkên ku alpha-2 giardine û alpha-7.3 giardine hatine derzîkirin, kêm birînên tevna duodenalê hebûn, ku bi zirara vîlûsê diyar dibin, li gorî mêşên ku bi G. duodenalis û mêşên ku bi G. duodenalis hatine derzîkirin digel vektorek pcDNA3 vala .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 an P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 an P = 0,0055) û atrofiya krîptoyê kêm kir (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 an P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-AVA-7. , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 an P = 0,0191).Van encaman destnîşan dikin ku alpha-2 giardine û alpha-7,3 giardine enfeksiyona G. duodenalis bi çalakkirina înflamazoma NLRP3 di vivo de kêm dike.
Rola pcDNA3.1 (+) -giardins di enfeksiyona G. duodenalis de.Mişk bi plasmîdên îfadeya eukaryotî yên rekombînant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine an jî pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine hatin parastin (IM) û dûv re bi kîstên G. duodenalis (ig) hatin bertengkirin.Koma PBS û pcDNA3.1 (+) + koma dermankirina kîsta duodenal wekî komên kontrola neyînî, û koma dermankirina kîsta duodenal wekî koma kontrolê ya erênî hate bikar anîn.Koma ezmûnî û rejima dermankirinê.b MT ya mişkan di her yek ji komên dermankirinê yên cihêreng de 7 rojên piştî dijwariyê hate şopandin.Stêrk cudahiyên girîng di navbera komên di koma G. duodenalis û koma pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine de destnîşan dikin, *P <0.05, **P <0.01, û ***P <0.001;nîşana dolarê ($) di navbera her komek G. duodenalis û koma jardine ya pcDNA3.1(+)-alpha-7.3, $$P<0.01 û $$$P<0.001 de ferqeke girîng nîşan dide.c Barkirina parazît bi jimartina hejmara trofozoîtên di 1 ml lavava duodenal de ji duodenumê (dirêj 3 cm) hate destnîşankirin û wekî hejmara parazîtan li her cm duodenumê hate destnîşan kirin.Cudahiyên di navbera koma enfeksiyona G. duodenalis, koma giardine pcDNA3.1 (+) -alpha-2, û koma giardine pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 de bi ANOVA yek-alî bi karanîna nermalava SPSS versiyona 22.0 ve hatin analîz kirin.Stêrk cudahiyên girîng li **P<0.01 û ***P<0.001 nîşan didin.d Guhertinên histopatolojîkî yên di duodenumê de.Tîrên sor zerara villiyan, tîrên kesk jî zirara diranan nîşan dide.Bara pîvanê: 100 μm.e, f Analîzên îstatîstîkî yên bilindahiya vîlûsê duodenal ê mişkî (e) û bilindahiya krîptê (f).Cûdahiyên di navbera komên di Xiflteya 1d de bi ANOVA-ya yekalî ve bi karanîna guhertoya nermalava SPSS 22.0 ve hatine analîz kirin.Stêrk cudahiyên girîng li *P<0.05 û **P<0.01 nîşan didin.Encamên heft ceribandinên biyolojîkî yên serbixwe.ns, ne girîng (P > 0.05)
Giardia duodenum parazîtek rovî ya navdar a mirov û mammalên din e ku dibe sedema giardiasis.Di sala 2004-an de, ji ber belavbûna wê ya zêde di nav 6 salan de, nemaze di civakên bi statûya sosyo-aborî ya nizm de, ew di nav Înîsiyatîfa Nexweşiyên Neguhestî yên WHO de bû [32].Pergala xweparastinê ya zikmakî di berteka xweparastinê ya li hember enfeksiyona G. duodenalis de rolek girîng dilîze.Hat ragihandin ku makrofagên mişk G. duodenalis bi berdana xefikên derveyî hucreyê dihelînin û dikujin [33].Lêkolînên me yên berê destnîşan kirin ku G. duodenalis, parazîtek derveyî hucreyî ya ne-dagirker, rêyên nîşana înflamatuara p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, û NLRP3 di makrofajên mişkî de çalak dike da ku bersivên înflamatuar ên mêvandar birêkûpêk bike, û GEV-ya serbest dibe ku vê pêvajoyê zêde bike.13], 24].Lêbelê, PAMP-ên rastîn ên ku di GEV-ê de iltîhaba birêkûpêk a NLRP3-ê ve girêdayî ne û rola înflamazoma NLRP3 di giardiasis de dimîne ku were ronî kirin.Ji bo ronîkirina van her du pirsan, me ev lêkolîn kir.
Inflammasome NLRP3 di nav sîtoplazmaya hucreyên parastinê de cih digire û dikare ji hêla perçeyên cihêreng ên wekî krîstalên asîda uric, toksîn, bakterî, vîrus û parazîtan ve were çalak kirin.Di lêkolînên bakteriyan de, toksîn wekî PAMP-ên sereke hatine nas kirin ku senzorên înflamatuar çalak dikin, ku rê li ber iltîhaba û mirina hucreyê vedike [34].Hin toksînên cihêreng ên strukturî, wek hemolysin ji Staphylococcus aureus [35] û Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) ji enterotoxin (NHE) [37], aktîvkirina iltîhaba NLRP3 vedihewîne.Lêkolînên vîrus destnîşan kirin ku proteînên virulence yên wekî proteîna zerfê (E) SARS-COV-2 [38] û proteîna NS5 ya virusa Zika [39] PAMPên girîng in ku ji hêla receptorê NLRP3 ve têne nas kirin.Di lêkolînên parazîtan de, gelek parazît hatine ragihandin ku bi çalakkirina înflamazoma mêvandar re têkildar in, wek Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], û Leishmania [42].Proteînên granulê yên dagirtî GRA35, GRA42, û GRA43, ku bi zerarbûna Toxoplasma gondii re têkildar in, ji bo peydakirina pyroptosis di makrofajên mişka Lewis de hewce ne [43].Wekî din, hin lêkolînên Leishmania balê dikişînin ser molekulên takekesî yên ku di înflamazoma NLRP3 de têkildar in, wek mînak lipophosphoglycan membrana parazît [44] an zinc metalloprotease [45].Di nav malbata genên alpha-giardin ên mîna annexin de, alpha-1 giardin wekî berendamek vakslêdanê ya potansiyel e ku di modelek mişkî de li dijî G. duodenalis parastinê peyda dike [18].Di lêkolîna xwe de, me faktorên nexweşiyê yên G. duodenalis alpha-2 û alpha-7,3 giardine hilbijart, ku ji giardia re yekta ne lê bi nisbet kêm hatine ragihandin.Van du genên armanc ji bo analîzkirina aktîvkirina înflamatuar di vektora pergala îfadeya eukaryotî ya pcDNA3.1 (+) de hatin klon kirin.
Di modela meya mişkê de, perçeyên kaspase yên şikestî wekî nîşankerên aktîvkirina înflamatuar kar dikin.Li ser teşwîqkirinê, NLRP3 bi ASC re têkilî dike, procaspases peyda dike, û kapasazên çalak çêdike ku pro-IL-1β û pro-IL-18 bi rêzê -18-ê IL-1β û IL-18-a gihîştî vediqetînin.Kapasên înflamatuar (caspase-1, -4, -5 û -11) malbatek parastî ya proteazên cysteine ​​ne ku ji bo parastina cewherî krîtîk in û beşdarî iltîhaba û mirina hucreyê ya bernamekirî ne [46].Caspase-1 ji hêla înflamazomên kanonîkî [47] ve tê çalak kirin, dema ku kapas-4, -5, û -11 di dema avakirina înflamazomên atîpîkî de têne qut kirin [48].Di vê lêkolînê de, me makrofajên peritoneal ên mişkî wekî modelek bikar anîn û di lêkolînên enfeksiyona G. duodenalis de p20 caspase-1 kaspase-1 veqetandî wekî nîşanek çalakkirina iltîhaba NLRP3 ya mêvandar lêkolîn kir.Encaman destnîşan kir ku gelek alfa-giardîn berpirsiyar in ji bo aktîvkirina tîpîk a iltîhabayê, ku bi vedîtina molekulên sereke yên vîrusê yên ku di bakterî û vîrusan de têkildar in re têkildar e.Lêbelê, lêkolîna me tenê ekranek pêşîn e û molekulên din hene ku dikarin înflamazomên ne-klasîk çalak bikin, ji ber ku lêkolîna meya berê hem înflamazomên klasîk û hem jî ne-klasîk di enfeksiyona G. duodenalis de dît [13].Ji bo ku em bêtir diyar bikin ka kaspase-1-a p20-ya hatî çêkirin bi înflamazoma NLRP3 re têkildar e, me giardîn alpha-2 û alpha-7.3 veguhezand makrofajên peritoneal ên mişkî da ku asta îfadeya proteîna molekulê ya sereke û astên oligomerîzasyona ASC-ê destnîşan bikin, piştrast kir ku her du α-giardîn çalak dikin. iltîhaba NLRP3.Encamên me hinekî cûda ne ji yên Manko-Prykhoda et al., yên ku ragihandin ku teşwîqkirina hucreyên Caco-2 bi G. muris an E. coli EPEC çewsên tenê dikare şiyana floransê ya NLRP3, ASC, û caspase-1 zêde bike. her çend ne girîng be jî, lê dema ku çawa bihevrebûna G. muris û E. coli asta sê proteînan zêde kir [49].Dibe ku ev cûdahî ji ber cûdahiyên di hilbijartina celebên Giardia, rêzikên hucre û hucreyên bingehîn de be.Me di heman demê de ceribandinên in vivo bi karanîna MCC950 di mêşên mê WT C57BL/6 yên 5-hefteyî de, yên ku ji G. duodenalis re hesastir in, pêk anîn.MCC950 înhîbîtorek NLRP3 ya molekulek piçûk a hêzdar û bijartî ye ku çalakkirina NLRP3-ya kanonîkî û ne-kanonîkî ya di giraniya nanomolar de asteng dike.MCC950 çalakkirina NLRP3 asteng dike lê bandorê li çalakkirina AIM2, NLRC4, û NLRP1 rêyên înflamatuar an rêyên nîşana TLR nake [27].MCC950 çalakkirina NLRP3 asteng dike lê destpêkirina NLRP3, K+ flux, ketina Ca2+, an têkiliya di navbera NLRP3 û ASC de asteng nake;di şûna wê de, ew çalakkirina înflamazoma NLRP3 bi astengkirina oligomerîzasyona ASC [27] asteng dike.Ji ber vê yekê, me MCC950 di lêkolînek in vivo de bikar anî da ku rola înflamazoma NLRP3 piştî derzîlêdana giardine diyar bike.Kaspase-1 p10 aktîfkirî sîtokînên pro-înflamatuar pro-IL-1β û pro-IL-18 di nav IL-1β û IL-18 gihîştî de vediqetîne [50].Di vê lêkolînê de, asta IL-1β ya serumê di mêşên ku bi giardine-dermankirî bi an bêyî MCC950 re wekî nîşanek hate bikar anîn ku ka înflamazoma NLRP3 çalak bûye.Wekî ku tê hêvî kirin, dermankirina MCC950 bi girîngî asta IL-1β ya serum kêm kir.Van daneyan bi zelalî destnîşan dikin ku G. duodenalis giardin alfa-2 û giardin alfa-7.3 dikarin înflamasoma mişka NLRP3 çalak bikin.
Daneyên girîng ên ku di deh salên borî de hatine berhev kirin destnîşan kirin ku IL-17A rêgezek sereke ya bêparastinê ye li dijî G. muris, îşaretkirina IL-17RA çêdike, peptîdên antîmîkrobîal çêdike, û aktîvkirina temamkerê birêkûpêk dike [51].Lêbelê, enfeksiyona Giardia di mezinên ciwan de pir caran diqewime, û hate ragihandin ku enfeksiyona Giardia di mişkên ciwan de bersiva IL-17A çalak nake da ku bandora xwe ya parastinê bike [52], û lêkolîneran dihêle ku li Giardia din ên immunomodulatory bigerin.mekanîzmayên enfeksiyona helminth.Nivîskarên lêkolînek vê dawîyê ragihandin ku G. muris dikare înflamazoma NLRP3 ji hêla E. coli EPEC ve çalak bike, ku hilberîna peptîdên antîmîkrobial pêşve dike û kapasîteya girêdana wê û hejmara trofozoîtên di nav rûvî de kêm dike, bi vî rengî giraniya kolonê kêm dike. nexweşiyên ku ji baciliyan pêk tên [49].Inflammasome NLRP3 di pêşveçûna nexweşiyên cûda de beşdar e.Lêkolînan destnîşan kir ku Pseudomonas aeruginosa otofagiyê di makrofageyan de çêdike da ku ji mirina hucreyê dûr bixe, û ev pêvajo bi çalakkirina înflamazoma NLRP3 ve girêdayî ye [53].Ji bo N. caninum, aktîvkirina navbeynkariya cureyên oksîjena reaktîf a înflamazoma NLRP3 dubarekirina wê di mêvandar de sînordar dike, û ew dike armancek dermankirinê ya potansiyel [9].Paracoccidioides brasiliensis hate dîtin ku çalakkirina înflamazoma NLRP3 di şaneyên dendrîtîk ên ji mêjûya hestiyê mişkê de vedihewîne, di encamê de cytokine iltîhaba IL-1β, ku di parastina mêvandar de rolek girîng dilîze [10].Çend cureyên Leishmania, di nav de L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, û L. infantum chagasi, NLRP3 û caspase-1-a girêdayî ASC-ê di makrofageyan de çalak dikin, û her weha enfeksiyona Leishmania.Vejandina parazîtan di mêşên ku di gena NLRP3/ASC/caspase-1 de kêm in [11] zêde dibe.Zamboni et al.Hat ragihandin ku enfeksiyona Leishmania çalakkirina înflamazoma NLRP3 di makrofage de vedihewîne, ku dubarekirina parazîta hundurîn sînor dike.Bi vî rengî, Leishmania dibe ku çalakkirina NLRP3 wekî stratejiyek dûrgirtinê asteng bike.Di lêkolînên in vivo de, înflamazoma NLRP3 beşdarî rakirina Leishmania bû, lê bandor li ser tevneyan nekir [54].Berevajî vê, di lêkolînên helminthiasis de, aktîvkirina înflamazoma NLRP3 berevaniya parastinê ya mêvandar li dijî helminthiasis gastrointestinal tepis kir [12].Shigella yek ji bakteriyên sereke ye ku li seranserê cîhanê dibe sedema îshalê.Van bakterî dikarin hilberîna IL-1β bi navbeynkariya K+-ê bi navbeynkariya P2X7, celebên oksîjenê yên reaktîf, asîdabûna lîzozomî, û zirara mîtokondrîal ve hilberînin.Inflammasoma NLRP3 bi awayekî neyînî fagosîtoz û çalakiya bakterîkujî ya makrofageyan li dijî Shigella rê dide [55].Lêkolînên plazmodyûmê destnîşan kirin ku mêşên kêmasiya AIM2, NLRP3 an caspase-1 ên ku bi Plasmodium vegirtî ne astên bilind ên înterferona celeb 1 hilberînin û ji enfeksiyona Plasmodium re berxwedêr in [56].Lêbelê, rola alpha-2 giardine û alpha-7.3 giardine di tehlîlkirina çalakkirina pathogenîk a iltîhaba NLRP3 di mişkan de ne diyar e.
Di vê lêkolînê de, astengkirina înflamazoma NLRP3 ji hêla MCC950 ve BW kêm kir û hejmara trofozoîtan di şilava lavageya rovî de di mişkan de zêde kir, ku di encamê de di tevna duodenal de guherînên patholojîkî yên girantir çêdibe.Alpha-2 giardine û alpha-7.3 giardine înflamazoma NLRP3 ya mişkê mêvan çalak dike, giraniya laşê mişk zêde dike, hejmara trofozoîtên di şilava lavajê de kêm dike û birînên duodenal ên patholojîk kêm dike.Van encaman destnîşan dikin ku G. duodenalis dikare bi alpha-2 giardine û alpha-7,3 giardine ve înflamazoma mêvandarê NLRP3 çalak bike, û pathogenicîteya G. duodenalis di mişkan de kêm bike.
Bi hev re, encamên me destnîşan dikin ku alpha-2 û alpha-7.3 giardine çalakkirina înflamazoma mêvandarê NLRP3 dihêlin û enfeksiyona G. duodenalis di mişkan de kêm dike.Ji ber vê yekê, ev molekul ji bo pêşîlêgirtina giardiasis armancên sozdar in.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: nêrînek giştî.Herî dawî hat eşkere kirin ku Pat Inflamm ji dermanan re alerjîk e.2019; 13: 134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: vekolînek dermankoterapiyê.Nerîna Pisporê dermansazek.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, berxwedana derman û vedîtina armancên nû.Armancên dermanên Disord vedigire.2010; 10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, hwd. NLRP3 înflamasome û nexweşiyên înflamatuar.Oxide Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Rola înflamazomê di iltîhaba rûvî û penceşêrê de.Gastroenterology.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Çalakkirina înflamazoma NLRP3 ya kanonîk û atipîkî li xaçerêya toleransa berevaniyê û iltîhaba rûvî.pêşîgirtinê.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Çalakkirina înflamazomê ya NLRP3 bi navbeynkariya ROS di bersivdayîna enfeksiyona N. caninum de cih digire.Vektora parazît.2020; 13:449.